实时荧光定量PCR在人感染猪流感诊断中的作用
彭年才12 张镇西1 兰邹然3 黄兵3 李红东2 李明2 苗保刚2
1西安交通大学生物医学分析技术与仪器研究所 2西安天隆科技有限公司 3山东省动物疾病预防与控制中心
2009年4月30日
摘要：病原检测方法及仪器是人感染猪流感防控的关键环节，针对实时荧光定量PCR分子诊断核酸检测技术的先进性以及国产试剂和仪器的成熟性，本文分析了该技术在以往禽流感检测被采用的国家标准以及使用的广泛性，最后介绍了最新发布的美国CDC《针对人感染猪流感病毒治疗和预防的临时指南》和我国卫生部《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》，两部法规都将实时荧光定量PCR确定为人感染猪流感实验室检测的确诊方法。从以上情况可以获知：实时荧光定量PCR技术在人感染猪流感诊断中具有先进、快速、成熟、合法的特点，是一种法定的主流技术，将来实施中，国产化仪器和试剂都有保障。
关键词：人感染猪流感 猪流感诊断 快速检测 实时定量PCR Real-time RT-PCR
全球性的人感染猪流感公共卫生事件发展势头迅猛，发生国家众多，世界卫生组织29日晚已将全球流感大流行警告级别从4级提高到5级，我国也于28日召开了国务院常务会议对防控进行了部署。现在已进入关键的防控措施落实阶段，其中检测与诊断技术至关重要。
实时荧光定量PCR技术在以往禽流感诊断中的应用
众所周知，虽虽然本次人感染猪流感事件的病毒基因序列还在进一步确立当中，但本次疫情病原学基础明确，属于RNA病毒感染性疾病。回顾近年来感染RNA病毒的烈性传染病，如SARS、禽流感，世界卫生组织及我国卫生行政和技术部门相继制定了较为成熟的实验室检测和诊断标准，其中我国颁布的应用实时荧光定量PCR方法进行实验室检测和快速诊断的标准如《GB/T 19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT—PCR检测方法》、《GB/T 19438.2—2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT—PCR检测方法》、《GB/T 19438.3—2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT—PCR检测方法》等，同时我们也注意到近年来国家针对食品安全尤其是乳品检测和食物致病菌检测的实时荧光定量PCR检测标准，如《SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法：荧光PCR方法》和《SN/T 1870-2007 食品中致病菌检测方法：实时PCR法》。以上实时荧光定量PCR技术在禽流感及其它方面检测的国家标准是该技术在当前的人感染猪流感诊断中应用的基础和前提。
实时荧光定量PCR技术及在我国卫生应急中的应用要求
实时荧光定量PCR技术在猪流感诊断中的作用已有法规确立
人感染猪流感疫情发生后，美国疾病预防控制中心（CDC）于2009年4月28日发布了针对人感染猪流感病毒治疗和预防临时指南，西安天隆科技有限公司在第一时间将其翻译成中文版本[6]。其中规定了确诊病例的诊断方法：具有急性发烧呼吸道疾病的临床症状并且经实时荧光定量PCR (real-time RT-PCR)或病毒分离培养 (viral culture)实验室检测方法检验证实感染A（H1N1）型猪流感病毒。卫生部办公厅于4月30日印发了《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》的通知》[7]，其中在实验室检测和病例诊断报告章节，内容如下：
检测程序
呼吸道标本应首先应用real time RT-PCR方法检测A型流感病毒的M基因、Swine（ H1N1）的HA基因和NP基因，以及质控对照RNP基因。同时，接种MDCK细胞或SPF鸡胚进行病毒分离，并测定病毒的全基因组序列。
推荐检测方法
用Real-time RT-PCR方法检测猪流行性感冒（ H1N1病毒）病毒。
其他检测方法
快速流感抗原检测
病毒培养
免疫荧光法（或装配的IFA ）
显然，上述卫生部法规中，与“其他检测方法”不同，实时荧光定量PCR方法被法定为人感染猪流感诊断的推荐检测方法。
